談冠心舒通對(duì)腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦組織蛋白表達(dá)的影

　　腦血管病是臨床常見病、多發(fā)病，其發(fā)病率、病死率逐年升高，在這一疾病相應(yīng)的治療過程中發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注( Cerebral ischemia-reperfusion，I /R) 的病理生理過程起著重要的作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)腦I /R 損傷與細(xì)胞凋亡有著密切的關(guān)系，凋亡機(jī)制參與腦I /R 損傷已成為臨床研究的熱點(diǎn)。以往研究表明，冠心舒通具有調(diào)整、改善心血管功能的作用，它能減輕心肌缺血程度及減小梗塞面積、能降低血漿纖維蛋白原含量、抑制血小板黏附性和聚集性、改善血液流變性、增加冠脈血流量及改善心肌的供血供氧，對(duì)心肌缺血再灌注損傷有明確的保護(hù)作用，但對(duì)冠心舒通能否影響腦I /R 損傷的研究甚少，本實(shí)驗(yàn)通過檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及細(xì)胞凋亡的調(diào)控，旨在探究冠心舒通是否對(duì)腦I /R 損傷具有保護(hù)作用。

　　1 材料與方法

　　1.1 實(shí)驗(yàn)試劑冠心舒通膠囊( 咸陽步長制藥有限公司生產(chǎn)，每粒裝0.3 g，國藥準(zhǔn)字Z20020055，產(chǎn)品批號(hào)100101) ; 兔抗鼠Bcl-2 和Bax 抗體購于北京博奧森生物有限公司; SP 和DAB 試劑盒購于福州邁新生物有限公司; ELISA 試劑盒購于南京建成生物有限公司。

　　1.2 模型的制作采用線栓法，結(jié)扎大鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈建立腦I /R 模型。選長約5 cm、直徑0.24 mm的美國進(jìn)口尼龍實(shí)驗(yàn)栓線。用10% 水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，麻醉滿意后四肢及頭部固定，頸部正中做2 cm 豎切口，先分離左側(cè)頸總動(dòng)脈，再分離左頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈，避免刺激迷走神經(jīng)，沿頸內(nèi)動(dòng)脈向上走行分離翼腭動(dòng)脈，結(jié)扎根部。假手術(shù)組僅暴露頸總動(dòng)脈其他不作處理。造模成功標(biāo)準(zhǔn)清醒后評(píng)定: 

( 1) 右側(cè)前肢屈曲，不能完全伸展; 

( 2) 提尾時(shí)，右側(cè)前肢抓力減弱; 

( 3) 提尾時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈;

 ( 4)自由運(yùn)動(dòng)時(shí)，無方向性，向右側(cè)轉(zhuǎn)圈或傾倒; ( 5) 不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。造模成功后2 h 將栓線拔出形成再灌注模型。

　　1.3 動(dòng)物分組及給藥健康的Wistar 大鼠60 只( 吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號(hào): SCXK2007-吉大-0003) 。體重( 210 ±20)g，每組15 只，隨機(jī)分為假手術(shù)組、腦I /R 模型組、冠心舒通組; 冠心舒通組依據(jù)大鼠長期毒性試驗(yàn)分為:高劑量( 1 g /kg) 組和低劑量( 0.5 g /kg) 組，冠心舒通將其研磨制成懸濁液。造模前每組分別每日灌胃給予生理鹽水、生理鹽水、冠心舒通高劑量和冠心舒通低劑量，連續(xù)7 d; 缺血120 min 后松扎，傷口撒頭孢唑啉鈉粉末0.25 g 后逐層縫合，放回籠中飼養(yǎng);假手術(shù)組僅分離頸總動(dòng)脈，不做任何處理; 術(shù)后每天上午灌胃給予生理鹽水、生理鹽水、冠心舒通高劑量和冠心舒通低劑量，3 d 后水迷宮訓(xùn)練同時(shí)繼續(xù)給藥，連續(xù)7 d。

　　1.4 動(dòng)物檢測選取實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，去除死亡的和狀態(tài)極差的大鼠，每組各取10 只檢測。

　　1.5 檢測指標(biāo)

　　1.5.1 Morris 水迷宮測試測試潛伏期、經(jīng)過平臺(tái)次數(shù)和平臺(tái)象限停留時(shí)間，Morris 水迷宮訓(xùn)練7 d后，于第8 天測試。

　　1.5.2 大鼠血清中Bcl-2 和Bax 蛋白水平的檢測采用ELISA 法檢測，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

　　1.5.3 大鼠腦組織的病理改變采用HE 染色觀察，常規(guī)石蠟包埋，切片5 μm，光學(xué)顯微鏡下觀察。

　　1.5.4 大鼠腦組織中Bcl-2 和Bax 蛋白水平的檢測采用免疫組織化學(xué)-SP 法檢測，切片3 μm，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果: 細(xì)胞質(zhì)陽性呈棕黃色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核呈藍(lán)色。

　　1.5.5 大鼠腦組織中Bcl-2 和Bax mRNA 水平的檢測引物序列由上海生物工程公司合成。Bcl-2; 上游引物5'-CACATCTGGAGACTATAAGA-3'，下游引物5'- CTCTAAGTTGCGTTATCTAC-3'，產(chǎn)物242 bp;Bax: 上游引物5'-GCTAATGGAGGAGAAGAAGT -3'，下游引物5'-CTGACCTGTTGGACCTTGTG-3'，產(chǎn)物298 bp; 凝膠成像后用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。

　　1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

　　采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件，測試潛伏期、經(jīng)過平臺(tái)次數(shù)、平臺(tái)象限停留時(shí)間、大鼠血清中Bcl-2 及Bax 的蛋白水平和腦組織中Bcl-2、Bax 的蛋白及mRNA 水平，其數(shù)據(jù)均以x±s 表示，進(jìn)行t 檢驗(yàn)。

　　2 結(jié)果

　　2.1 測試潛伏期、經(jīng)過平臺(tái)次數(shù)和平臺(tái)象限停留時(shí)間的檢測與腦I /R 模型組比較，冠心舒通高劑量和低劑量組大鼠測試潛伏期均縮短、經(jīng)過平臺(tái)次數(shù)均增多、平臺(tái)象限停留時(shí)間均增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P<0.01) ，且冠心舒通高劑量組好于冠心舒通低劑量組，有顯著差異( P<0.p="">0.05) ，冠心舒通低劑量組大鼠測試潛伏期延長、經(jīng)過平臺(tái)次數(shù)和平臺(tái)象限停留時(shí)間減少，有顯著差異( P<0.01) ，腦I /R 模型組大鼠測試潛伏期明顯延長、經(jīng)過平臺(tái)次數(shù)和平臺(tái)象限停留時(shí)間明顯減少，有顯著差異( P<0.01) 。

　　2.2 腦組織的病理改變結(jié)果HE 染色結(jié)果假手術(shù)組: 腦組織細(xì)胞排列緊密整齊; 模型組: 腦組織細(xì)胞排列松散紊亂，細(xì)胞核濃縮，細(xì)胞質(zhì)淡染; 高劑量組: 腦組織細(xì)胞排列比較緊密整齊; 低劑量組: 腦組織細(xì)胞排列較為緊密整齊，可見細(xì)胞核濃縮，細(xì)胞質(zhì)淡染。

　　2.3 大鼠血清中Bcl-2 和Bax 蛋白的水平與腦I /R 模型組比較，冠心舒通高劑量和低劑量組血清中Bax 蛋白含量降低、Bcl-2 蛋白含量升高均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P<0.01) ，且冠心舒通高劑量組好于冠心舒通低劑量組，有顯著差異( P<0.bax="" bcl-2="" p="">0.05) ，冠心舒通低劑量組大鼠血清中Bax 蛋白含量升高、Bcl-2 蛋白含量降低，有顯著差異( P<0.01) ，腦I /R 模型組大鼠血清中Bax 蛋白含量明顯升高、Bcl-2 蛋白含量明顯降低，有顯著差異( P<0.01)。

　　2.4 大鼠腦組織中Bcl-2 和Bax 蛋白表達(dá)的水平與腦I /R 模型組比較，冠心舒通高劑量和低劑量組大鼠腦組織中Bax 蛋白含量降低、Bcl-2 蛋白含量升高均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P<0.01) ，且冠心舒通高劑量組好于冠心舒通低劑量組有顯著差異( P<0.bax="" bcl-2="" p="">0.05) ，冠心舒通低劑量組大鼠腦組織中Bax 蛋白含量升高、Bcl-2 蛋白含量降低有顯著差異( P<0.01) ，腦I /R 大鼠腦組織中Bax 蛋白含量明顯升高、Bcl-2 蛋白含量明顯降低有顯著差異( P <0.01) ; 采用Motic Images Advanced 3.2 圖像分析系統(tǒng)，灰度值越高陽性表達(dá)越低，灰度值越低陽性表達(dá)越高。

　　2.5 大鼠腦組織中Bcl-2 和Bax mRNA 的水平凝膠成像后用凝膠圖像分析儀分析結(jié)果，與腦I /R 模型組比較，冠心舒通高劑量和低劑量組大鼠腦組織中Bax mRNA 水平降低、Bcl-2 mRNA 水平升高均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P<0.01) ，且冠心舒通高劑量組好于冠心舒通低劑量組有顯著差異( P<0.bax="" bcl-2="" mrna="" p="">0.05) ，冠心舒通低劑量組大鼠腦組織中BaxmRNA 水平升高、Bcl-2 mRNA 水平降低，有顯著差異( P < 0.01 ) ，腦I /R 模型組大鼠腦組織中BaxmRNA 水平明顯升高、Bcl-2 mRNA 水平明顯降低有顯著差異( P<0.01) 。

　　3 討論

　　近年來隨著腦血管病發(fā)病率的逐年上升，腦血管病成為臨床常見的三大致死疾病之一，腦血管病尤其是缺血后再灌注損傷對(duì)腦的影響成為國內(nèi)學(xué)者研究缺血性腦損傷的熱點(diǎn)。眾多的研究表明腦缺血再灌注損傷過程中細(xì)胞凋亡發(fā)揮重要作用，機(jī)體的細(xì)胞凋亡過程中有多種蛋白參與調(diào)控，其中Bcl-2 蛋白家族是人們研究最多的一類凋亡蛋白，Bcl-2 蛋白家族分布在線粒體外膜等處，分為兩大類: 促凋亡類，如Bid、Bax、Bak 等，也就是Bax 能促進(jìn)細(xì)胞凋亡; 抑凋亡類，如Bcl-2、Bcl-X1 等，也就是Bcl-2 能抑制細(xì)胞凋亡; 這兩類蛋白可通過形成異二聚體發(fā)揮相互拮抗或放大作用，因此研究Bcl-2 和Bax 的表達(dá)趨勢是決定細(xì)胞凋亡與否的主要因素。

　　冠心舒通膠囊由廣棗、丹參、丁香、冰片、天竺黃等組成，其中廣棗的有效藥理成分為廣棗總黃酮，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明能顯著延長小鼠的耗氧速度、提高小鼠耐缺氧的能力、顯著延長小鼠痛覺反應(yīng)潛伏期( 熱板法) 或顯著減少醋酸刺激引起的扭體反應(yīng)次數(shù); 天竺黃對(duì)離體兔耳血管有直接擴(kuò)張作用，小鼠實(shí)驗(yàn)有顯著抑制毛細(xì)血管通透性作用; 丹參的有效成分是丹參酮臨床試驗(yàn)結(jié)果表明能改善冠心病、心絞痛和胸悶等癥狀，且以往的研究表明: 廣棗能抑制心肌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡; 丹參抗神經(jīng)元細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡且能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡; 丁香、冰片及天竺亦具有抗海馬神經(jīng)元凋亡和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，其根本在于這5 種有效成分能通過阻止線粒體膜電位的下降和線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔的開放，抑制線粒體促凋亡的蛋白質(zhì)如細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子( AIF) 等的釋放，從而防止細(xì)胞凋亡發(fā)生。因此本實(shí)驗(yàn)復(fù)制大鼠腦I /R損傷模型，給予高、低劑量的冠心舒通后檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及腦組織Bcl-2 和Bax 的蛋白及mRNA的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明冠心舒通高劑量和低劑量組大鼠測試潛伏期均縮短、經(jīng)過平臺(tái)次數(shù)均增多、平臺(tái)象限停留時(shí)間均增加( P<0.01) ，且冠心舒通高劑量組好于冠心舒通低劑量組有顯著差異( P<0.bax="" mrna="" bcl-2="" p="">0.05) ，低劑量組大鼠血清和腦組織中Bax 蛋白含量及mRNA 水平升高、Bcl-2 蛋白含量及mRNA 水平降低有顯著差異( P<0.01) ，腦I /R 模型組大鼠血清和腦組織中Bax 蛋白含量及mRNA 水平明顯升高、Bcl-2 蛋白含量及mRNA 水平明顯降低有顯著差異( P<0.01) ，提示冠心舒通能提高腦I /R 損傷大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力; 能下調(diào)Bax 蛋白、上調(diào)Bcl-2 蛋白的水平對(duì)腦I /R 損傷大鼠的腦組織具有保護(hù)作用; 并證實(shí)冠心舒通高劑量組好于低劑量組，這是冠心舒通治療缺血性腦血管病作用機(jī)制之一，其他機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究。

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