研究3,5,2,4菜聶腔查爾酮對高尿酸血癥小鼠尿酸排泄的影響論文
痛風(gout)是由于體內尿酸結晶沉積到軟組織，引發(fā)急、慢性炎癥和組織損傷，出現(xiàn)臨床癥狀和體征的一組臨床綜合征。通常認為高尿酸血癥是痛風最重要的生化基礎，據統(tǒng)計有5% ～12%的高尿酸血癥最終可發(fā)展為痛風。任何原因引起尿酸生成增多和(或)排泄減少均可導致高尿酸血癥，其中尿酸排泄減少約占原發(fā)性高尿酸血癥患者的90%。腎臟在尿酸的排泄中占有重要地位，體內2/3的尿酸由腎臟排泄，經過腎小球濾過、腎小管重吸收、再分泌和再吸收而排出體外，其中腎小管對尿酸的重吸收是影響血尿酸水平的主要環(huán)節(jié)。近年的研究認為腎臟的尿酸轉運體URAT1/SLC22A12GLUT9/SLC2A9參與了尿酸的重吸收。
3，5，2′，4′菜聶腔查爾酮(C15H12O5，P40)(Fig1)是中國科學院昆明植物所朱華結研究員課題組以3，5捕羥基苯甲酸為原料合成的查爾酮類化合物。該類化合物存在于甘草、啤酒花、鐮形棘豆等藥用植物中，由于其分子結構有較大柔性，能與不同的受體結合，具有廣泛的生物活性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)P40具有較強的降尿酸作用，其機制與抑制黃嘌呤氧化酶/黃嘌呤脫氫酶(XOD/XDH)的活性有關。然而，P40的化學結構不同于上市的黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌醇和非布索坦，很可能存在新的作用機制和靶點。鑒于腎臟在尿酸排泄中的重要作用，本研究擬從腎臟尿酸排泄角度探討P40的降尿酸作用及其分子機制，為闡明P40的作用機制提供科學依據。
1.材料
1.1 實驗動物
昆明種小鼠，♂，體質量18～22g，由四川成都達碩生物科技有限公司提供，實驗動物生產許可證號：[SCXK(川)2011-24]，自由飲食。
1.2 主要材料與試劑
3，5，2’，4’菜聶腔查爾酮：由中國科學院昆明植物所朱華結研究員課題組合成并提供，分子質量為272.25;苯溴馬�。旱聡章笏帍S生產，由昆山龍燈瑞迪制藥有限公司分裝;尿酸：購于Sigma公司;尿酸測定試劑盒：南京建成生物技術有限公司生產;URAT1抗體：購于Protein公司;GLUT9抗體：購于Sigma公司;β瞐ctin、山羊抗兔IgG/辣根酶標記：Abmart公司。
1.3 儀器
全波長酶標儀：MolecularDevices公司，型號：SPECTRAMAX190;電熱恒溫水浴箱：北京長風公司，型號：HH·W21;高速冷凍離心機：HERM睱E公司，型號：Z300K;酶標板：美國Costar公司。
2 方法
2.1 動物分組及給藥
選取標準體質量(18～22g)♂昆明小鼠60只，隨機分為正常組、高尿酸血癥模型組、P40(20、40、80mg·kg-1)劑量組、苯溴馬隆125mg·kg-1組，各給藥組共灌胃給藥5次，每天兩次;腹腔注射尿酸150mg·kg-13次誘導形成高尿酸血癥小鼠，正常對照組則注射等體積溶媒。末次腹腔注射尿酸前40min灌胃給予各受試藥物，給藥后1h眶靜脈取血，3000r·min-1離心10min，取血清;斷頸處死小鼠，迅速分離肝臟和腎臟，液氮凍存后于-80℃保存?zhèn)錅y。磷鎢酸法測定小鼠血尿酸水平和肝尿酸含量。
2.2 RT睵CR檢測腎臟URAT1、GLUT9基因表達水平
小鼠URAT1、GLUT9引物采用DNAMAN6.0設計(Tab1)，經PubMedBLAST驗證后，由上海生工生物工程有限公司合成。每組隨機選取4例凍存的小鼠腎臟，提取總RNA后，ND1000定量，并進行逆轉錄，隨后進行擴增。URAT1的擴增條件為：94℃ 2min、94℃ 30s、58℃ 35s、72℃ 45s、72℃ 10min、4℃ 30cycles，GLUT9的擴增條件為：94℃ 2min、94℃ 30s、57.7℃35s、72℃ 45s、72℃ 10min、4℃ 30cycles。電泳后的瓊脂糖凝膠用BIO睷AD凝膠成像系統(tǒng)進行凝膠成像，并對條帶進行灰度比值分析。
2.3 Westernblot檢測腎臟URAT1、GLUT9蛋白的表達水平
取凍存的小鼠腎臟，每組4例，組織裂解液提取小鼠腎臟組織總蛋白，BCA法進行蛋白定量。蛋白與上樣緩沖液的比例為1∶4，混勻后95℃10min煮沸變性，進行SDS睵AGE電泳;濕法轉至PVDF膜;脫脂奶粉37℃搖床封閉膜2h;4℃過夜孵育URAT1、GLUT9一抗(1∶1000)、β瞐ctin(1∶1000);TBST洗膜，室溫搖床孵育辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶2000)1h;TBST洗膜，ECL化學發(fā)光。BIO睷AD系統(tǒng)成像，URAT1、GLUT9蛋白的相對表達量用URAT1、GLUT9與β瞐ctin的光密度比值進行計算。
2.4 統(tǒng)計學分析
數據用珋x±s表示，采用單因素方差分析，用SPSS170軟件進行統(tǒng)計學處理。
3 結果
3.1 P40對尿酸誘導的高尿酸血癥小鼠血尿酸水平和肝尿酸含量的影響 與正常組比較，模型組小鼠血尿酸水平明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<001)，提示模型復制成功;灌胃給予P40后，P40(40、80mg·kg-1)組及苯溴馬隆組血尿酸水平明顯下降，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<005)，并呈現(xiàn)劑量-效應關系;與正常組比較，模型組及各給藥組肝尿酸水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<001);各給藥組的肝尿酸水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義(p>005。
3.2 P40對尿酸誘導的高尿酸血癥小鼠腎臟URAT1基因、蛋白表達水平的影響 由Fig2可看出小鼠腎臟URAT1基因表達水平無變化。模型組URAT1蛋白表達上調，與正常組相比，差異具有統(tǒng)計學意義;P40各系列給藥組UART1蛋白表達均有下調趨勢，但與模型組相比，差異無統(tǒng)計學意義;苯溴馬隆組下調URAT1蛋白表達，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學意義。
3.3 P40對尿酸誘導的高尿酸血癥小鼠腎臟GLUT9基因、蛋白表達水平的影響 由Fig3可見，模型組GLUT9基因表達有上調趨勢，但與正常組相比，無統(tǒng)計學意義;P40各給藥組以及苯溴馬隆組其基因表達有下調趨勢，但與模型組相比，差異無統(tǒng)計學意義。模型組GLUT9的蛋白表達上調，與正常組相比，差異具有統(tǒng)計學意義;P4040、80mg·kg-1給藥組GLUT9蛋白表達下調，并呈現(xiàn)一定的劑量-效應關系，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學意義;而P4020mg·kg-1給藥組有下調GLUT9蛋白表達的趨勢，但與模型組相比，差異無統(tǒng)計學意義;苯溴馬隆組對其蛋白表達沒有影響。
4 討論
尿酸是人類嘌呤代謝的終末產物，由次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下生成黃嘌呤，再在該酶的作用下進一步生成尿酸，而肝臟作為黃嘌呤氧化酶的高表達器官，是尿酸生成的主要場所，對機體尿酸的穩(wěn)態(tài)起著重要的調節(jié)作用。體內生成70%的尿酸經由腎臟排泄。因此，增加體內尿酸、尿酸前體(次黃嘌呤、黃嘌呤)的量或抑制腎臟尿酸的排泄均可引起血尿酸水平的增高導致高尿酸血癥。本研究采用直接補充大劑量的外源性尿酸誘導形成高尿酸血癥小鼠，在不影響小鼠自身尿酸生成的前提下，觀察P40對尿酸排泄的影響。結果表明P40劑量依賴性地降低了高尿酸血癥小鼠的血尿酸水平，與促尿酸排泄藥苯溴馬隆相似，提示P40具有促進尿酸排泄的作用。此外，在本實驗條件下，模型組及各用藥組的肝臟尿酸含量均低于正常組，提示大劑量的外源性尿酸進入機體后，有可能抑制了肝尿酸的生成。
研究發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細胞頂端膜和基底膜上的多個轉運蛋白與尿酸的重吸收和分泌有關，其中尿酸轉運體URAT1/SLC22A12和GLUT9/SLC2A9參與了尿酸的重吸收。URAT1和GLUT9分別表達于腎近端小管上皮細胞的頂端膜與基底膜，URAT1將尿酸從小管液中攝入小管細胞內，再經GLUT9泵出小管細胞基底膜，進入細胞間質和外周血管。URAT1基因突變將導致轉運體功能減退或喪失而表現(xiàn)出腎性低尿酸血癥，提示URAT1是影響血尿酸水平的`一個重要的轉運蛋白。苯溴馬隆即是以URAT1為靶點的促尿酸排泄藥，本實驗條件下也觀察到苯溴馬隆干預了該轉運體的蛋白表達，然而，P40則對高尿酸血癥小鼠腎臟URAT1的基因、蛋白表達均無太大影響，初步提示P40促尿酸排泄作用的靶點并非URAT1。
GLUT9主要表達于腎臟和肝臟，雖然是葡萄糖轉運體家族成員之一，與GLUTs有相似的氨基酸序列，然而，其轉運葡萄糖和果糖的能力較低。新近研究顯示GLUT9與尿酸的轉運密切相關，是一種高能尿酸轉運體。該轉運體以電壓依賴的方式將尿酸從小管細胞內轉運至細胞間質和外周血管中，它的轉運功能并不依賴于Na+，而當細胞外K+濃度升高時，其轉運功能增強，故又稱為電勢驅動尿酸轉運蛋白1(voltagedrivenuratetransporter1，URATv1)。本實驗結果顯示P40明顯降低高尿酸血癥小鼠腎臟GLUT9蛋白的表達，而對GLUT9的mR睳A水平僅有下調趨勢，并未達到顯著統(tǒng)計學意義，說明P40主要干預了GLUT9蛋白的合成，而對基因的轉錄過程影響不明顯。此外，本研究顯示苯溴馬隆對GLUT9的mRNA和蛋白表達均無明顯影響，提示P40促進尿酸排泄的機制與苯溴馬隆不同，可能是通過下調GLUT9蛋白的表達，減少尿酸的重吸收而起到降尿酸的作用。
綜上所述，P40具有促進高尿酸血癥小鼠尿酸排泄的作用，其機制與下調GLUT9蛋白的表達有關。
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